双向电泳实验技术资料
主要仪器:
离心机、GE HealthCare双向电泳系统、摇床、A4投射扫描仪、Typhoo9400扫描仪等。
试剂耗材：
见最后页。
DIGE标记：
注：此为可选步骤，全程4℃、暗处操作。
1. 配好10 mM lysine，准备1ml DMF。
2. 样本要求，样本浓度在5-10μg/μl之间。样本可以根据其浓度稀释至该范围后再定量一次。样本需溶解在7M urea、2M Thiourea 、4%charps、30mM Tris-HCl pH8.5（4℃）中。
3. 配储液，染料复温5mim，离心使粉末落至管底。将染料溶于5μl DMF中，震荡30s，离心恢复体积。此时其浓度为1nM/μl。取本实验所需量后用封口胶封严管口。
4. 配工作液，以一个样本为例： 0.4μl储液加0.6μl DMF混合，此时其浓度400pM/μl。
5. 标记，取50μg样本和1μl 工作液混合。反应30min。
6. 终止反应，1μl 10 mM lysine 混合后终止反应10min。
IEF电泳步骤：
1. 检查胶条槽，等电聚焦仪是否水平。
2. 准备上样液：上样量、上样体积、再水化液、DTT、BPB。
3. 将460μl上样液混合均匀后，12000g离心8分钟，取上层450μl用1ml枪将其均匀的加在胶条槽两电极间，必须无间断、无气泡。
4. 取出IPG干胶条，从正极端开始小心撕下保护膜，撕到负极端时应缓慢。将其正极端顶入胶条槽的正极端，胶面朝下缓缓放入槽内，尽量使液体分布均匀，不能有气泡。记下胶条编号和样本号。
5. 均匀覆盖1ml覆盖油。盖上盖子
6. 编辑IPGphor的IEF程序：
电流设置 50μA
Step 1： 30v 10-12h， step-n-hold.
Step 2： 500v 1h step-n-hold.
Step 3： 1000v 1h step-n-hold.
Step 4： 8000v 10h step-n-hold.
选择胶条总数。
Total：20-24h，＜100 000vh。根据实际情况调整参数。
注：血清等高盐样本第二、第三步各延长一小时，并增加1000-8000v的gradient步骤；DIGE电泳应避光
7. IEF完成时，记录总时间、总vh及8000v时间、vh等。胶条放入平衡管中，-80℃保存。
灌胶：
1. 准备干净玻璃板：铲胶后用洗洁精洗干净，1%Decon浸泡（6块板1000ml）过夜，海绵刷洗，自来水冲干净，1%盐酸浸泡过夜，海绵刷洗，冲洗干净，ddH2O涮洗。晾干。
2. 配Bind-silane工作液：每100ml含乙醇80ml、冰醋酸2ml、水18ml、Bind-silane 100μl。
3. 用少量酒精将玻璃板擦干净，用无尘纸将纸毛擦净。
4. 加3.5ml Bind-silane 工作液。涂匀，注意不能涂到space上面。1h后用涂再涂湿，去除尘埃。
5. 合玻璃板。将短板用酒精擦干。合上后能在水平面上站立位标准。
6. 准备灌胶槽。塑料片、槽内侧面、橡胶垫等不能沾水。在放海绵条的沟上挤满dd水，将海绵条按进沟内，使其充分泡胀，注意不要来回扯动。
7. 对好橡胶垫子，使其处于槽中间。
8. 在槽底面放一厚塑料片（注意圆角端朝外），然后玻璃板、厚塑料板依次放置，剩余空间用薄塑料板填满，放置时应不留空隙。
9. 装好灌胶槽盖子。将胶槽竖立于通风厨水平面上。
10. 准备灌胶瓶， 从4℃冰箱里取出moner、resolving buffer 。以6张12.5%胶为例：依次加入175.14ml moner,105ml resolving buffer, 4.2ml 10%SDS, 133.56ml ddH2O。除气15分钟。
11. 试剂柜中拿出APS和TEMED，称好APS 0.21g，溶于2.1ml ddH2O中。
12. 往灌胶瓶中均匀缓和加入APS和138.6μl TEMED。搅拌3分钟。
13. 沿槽斜沟缓缓灌入胶液，直到液面平space上缘。剩余胶液倒入小烧杯中。
14. 加饱和正丁醇（上层液为饱和正丁醇），沿胶面弧线缓缓向前推进滴加。
15. 用薄膜封口。过夜备用。
SDS-page电泳步骤：
1. 检查灌胶是否正常。准备好二向胶。
2. 配好电泳缓冲液。用具：2000ml，800ml量筒各一个；5000ml量杯一个。上槽2X 800ml，下槽 1X 4500ml。弃掉二向胶上的水，以上槽缓冲液覆盖之。将一半左右下槽液倒入电泳槽中，开通循环冷却设备。
3. 配置0.5%LM及1%NA的琼脂糖各40ml，煮沸。
4. 取出DTT及IAA复温。
5. 配置分子量Marker。剪好6张1x0.3 cm的滤纸。低分子量：15μl储液，30μl 1x sample buffer，45μl sealing buffer。立即混匀，离心恢复体积，稍煮使琼脂糖溶解，每张滤纸滴加10μl。
6. 取出平衡管复温。注意防止管盖暴脱。
7. 配置平衡液。注意在溶解DTT及IAA时不要产生过多气泡，溶解彻底。
8. 胶条平衡。用具：50ml离心管架子一个。方法：操作在水池边进行，将平衡管立于架子上。用15ml左右dd水涮洗一次。加DTT平衡液10ml后摇荡15分钟，弃液后加IAA平衡液10ml后震荡15分钟。弃液，使平衡管立于架子上。将架子转移至上二向胶工作区。
9. 胶条平衡时。。。。准备上二向胶工作区间，见图：
车子：玻璃板架，废液杯，桌布，镊子两把，剪刀，尺子，汲水纸，分子量Marker。
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10. 上二向胶。A：倒弃并汲干缓冲液，注意汲水纸不能触及胶面。B：取3ml左右0.5%琼脂糖填入玻璃板空隙中，液面不要有气泡。C：取出胶条（镊子夹胶条两边）后在上槽液中涮洗，将胶条贴于长玻璃板上，碱性端架于space上，依次剪去酸性端和碱性端，靠尺子重力使胶条下降到与page胶面接触，注意不能有气泡。
11. 将玻璃板放入电泳槽中。琼脂糖将凝固时，左右倾斜进入液面后反复上下冲击可赶走玻璃板下沿气泡。
12. 盖上上槽，用琼脂糖封住上槽与玻璃板之间的空隙。
13. 琼脂糖将凝时，同时加上、下槽液。盖盖，接电源，注意正负极。
14. 电泳程序：2-2.5W/胶 40分钟；17W/胶，6张胶100W，约6小时。
注：DIGE电泳温度10℃，避光
染色（每个染色盘需染液500ml）
胶体考染：
1. 染色液配置：（0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、20%MeOH。
锥形瓶中加入500mlH2O、100mlH3PO4（产热，缓加混匀）、100g（NH4）2SO4（边加边搅拌）再加1.2g G-250再溶解（其实不能真正溶解，用水定容至800ml，边搅边加入200ml MeOH。终体积1000ml（可保存半年）。充分溶解需较长时间，整个过程约2h.。
2. 染色：固定 40%MeOH+10%HAc 30min-over night。
漂洗 H2O 15minX4次。
染色 室温摇荡过夜
终止 H2O漂洗至背景清楚。
3. 脱色（可选）： 50%ACN+50%NH4HCO3（5mM） 2hX2次
100%ACN 10minX2次
100mM NH4HCO3
热考染：
1. 0.025%R350配置：1片Phast Gel Blue 溶入1.6L10%的acetic acid中。
2. 将染色液加热至90℃，倾倒至凝胶上，摇15min。
3. 脱色：10%acetic acid 脱色至背景发白，点清晰可见。
EMBL 银染：（时间以有一面贴在玻璃板上的胶为例，裸胶时间减半）
1.固定 50%MeOH、5%HA 40min
2.洗涤 50%MeOH 20min
3.洗涤 H2O ≧2h 洗涤过夜可减少背景。
4.敏化 0.02%Na2S2O3 2min
5.洗涤 H2O 2min 两次
6.加银 0.1%AgNO3 40min
7.洗涤 H2O 2min 两次
8.显色 0.04%formalin、2%Na2CO3 显色液变黄时立即换液，至可见蛋白点时终止。
9.终止 5%HAc
10.保存 1% HAc
Vorum 银染：（时间以有一面贴在玻璃板上的胶为例，裸胶时间减半）
1.固定 50%MeOH、5%HAc 2h
2.洗涤 35%EtOH 20min 三次
3.敏化 0.02% Na2S2O3 2min
4.水洗 H2O 5min 三次
5.加银 0.2%AgNO3 0.076%Formalin 20min
6.水洗 H2O 1min 两次
7.显色 6% Na2CO3，0.05%formalin，0.0004% Na2S2O3 液体变黄时换液；见点后马上终止
8.终止 50%MeOH，12%HAc 5min
9.保存 1%HAc 4℃保存。
试剂配置：
1. rehydration buffer stock
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Reagent
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Quantity
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Final concentration
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Urea (MW 60.06)
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10.5g
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7M
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Thiourea (MW 76.12)
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3.8g
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2M
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CHAPs (MW614.89)
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1g
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4%(W/V)
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Milli-Q 水至25ml，1.2或0.5ml分装，-80℃保存可保存半年。
使用前每2.5ml 加入5µl 1%Bromophenol blue solution,15.4mgDTT,0.5%即12.5µl IPG buffer
2. Bromophenol blue solution
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Reagent
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Final concentration
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Amount
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|
Bromophenol blue
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1%
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100mg
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Tris-base
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50mM
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60mg
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Double distilled water
|
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to 10ml
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室温保存
3. 4x resollving gel buffer (1.5M Tris-HCl pH8.8 1L)
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Reagent
|
Final concentration
|
Amount
|
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Tris -base (Fw121.1)
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1.5M
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181.7g
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Double distilled HO
|
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750ml
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HCl (Fw 36.46)
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adjust to pH8.8
|
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Double distilled water
|
|
to 1L
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0.45µm过滤，4ºC保存
4. 30%T, 2.6% C monomer stock solution
(30%acrylamide, 0.8%N,N’-methylenebisacrylamide, 200ml)
|
Reagent
|
Final concentration
|
Amount
|
|
Acrylamide (FW 71.08)
|
30%
|
60.0g
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N,N’-methylenebisacrylamide(FW154.17)
|
0.80%
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1.6g
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Double distilled water
|
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to 200ml
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0.45µm过滤，4ºC避光保存
5. Bind-Silane working solution.
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Reagent
|
Quantity
|
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Ethanol
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8 ml
|
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Glacial acetic acid
|
200µl
|
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Bind-Silane
|
10µl
|
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Double distilled H2O
|
1.8 ml
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6. 10%SDS
|
Reagent
|
Final concentration
|
Amount
|
|
SDS (FW 288.38)
|
10%(w/v)
|
5.0g
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Double distilled water
|
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to 50ml
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0.45µm过滤，室温保存。
7. 12.5%SDS-PAGE凝胶配方
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Reagents
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Volumn of reagents
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1
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2
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3
|
4
|
5
|
6
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Monomer solution
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50.04ml
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75.06ml
|
100.08ml
|
125.1ml
|
150.12ml
|
175.14ml
|
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4×resolving gel buffer
|
30ml
|
45ml
|
60ml
|
75ml
|
90ml
|
105ml
|
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10%SDS
|
1.2ml
|
1.8ml
|
2.4ml
|
3.0ml
|
3.6ml
|
4.2ml
|
|
Double distilled water
|
38.16ml
|
57.24ml
|
76.32ml
|
95.4ml
|
114.48ml
|
133.56ml
|
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10%ammonium persulfate
|
600µl
|
900µl
|
1200µl
|
1500µl
|
1800µl
|
2100µl
|
|
TEMED
|
39.6µl
|
59.4µl
|
79.2µl
|
99µl
|
118.8µl
|
138.6µl
|
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Total volumn
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120ml
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180 ml
|
240 ml
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300 ml
|
360 ml
|
420 ml
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8. SDS equilibration buffer
(50mM Tris-HCl Ph8.8 , 6M Urea , 30% glycerol , bromophenol blue 200ml )
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Reagent
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Final concentration
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Amount
|
|
Tris-HCl pH8.8
|
50mM
|
20.0ml (13.3ml 4x resollving gel buffer)
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Urea (MW 60.06)
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6M
|
144.14g
|
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Glycerol (87% v/v)
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30%(v/v)
|
138ml
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SDS (FW 288.38)
|
2% (w/v)
|
8.0g
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Bromophenol blue
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0.002%(w/v)
|
800µl of 1%solution
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Double distilled water
|
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to 400ml(65ml溶解，再加至400ml)
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40ml分装，-20ºC保存。
9. Equilibration of IPG strips prior to SDS PAGE:
2%SDS. 50mMTris Ph8.8. 6M Urea . 30%(v/v)glycerol . 0.002% bromophemol blue
15 min 10ml +100mgDTT
15 min 10ml +250mgIAA
10. 10X SDS electrophoresis buffer
(250Mm Tris-HCl. pH8.3, 1920mm glycine, 1%SDS, 1L)
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Reagent
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Final concentration
|
Amount
|
|
Tris-base (FW 121.1)
|
250mM
|
30.3g
|
|
|
1920mM
|
144.0g
|
|
SDS (FW288.38)
|
1%(w/v)
|
10.0g
|
|
Double distilled water
|
|
to 1L
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11. Agarose sealing solution
|
Reagent
|
Final concentration
|
Amount
|
|
Upper SDS electrophoresis buffer
|
|
100ml
|
|
Agarose (LM)
|
0.50%
|
0.5g
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|
Bromophenol blue
|
0.002%(w/v)
|
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转染和转化的区别