5．单管测试进行实验方案可行性尝试，首先要在多种温度，多种Mg离子、多种添加剂加入的情况下进行方案的可行性测试，对于所有单管测试的结果都送去测序，以保证序列的正确性，在实验结果得到确认的基础上，挑选稳定的方案进入中试过程。

6．中试抽取8个样品做小规模批量实验，以模拟和检查批量PCR情况和酶切情况。

7．大规模实验准备将DNA模板按方案进行一次性分板(有冗余)，并引入阳性和阴性对照，同时将所有相关的PCR体系进行一次性大规模分装，防止污染。　

8．第一板数据先用一板模板进行一轮PCR和酶切，以检验体系和分板的情况。　

9．正式实验

相关技术要点　

1．实验设计必需保证野生型的被限制性内切酶切开因为对于只有少量突变型的SNP位点，如果突变型被切开，那么所得到的实验结果就是大量没有被酶切开的PCR产物，而这个结果与酶切实验失败的结果非常类似，不易区分，对结果的判读造成很大的麻烦，因此保证了主频碱基被解开，从根本上保证了实验的可靠性。

2．偏向性扩增的解决。所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。为此，本公司专门设计一个方案，用以克服偏向性扩增。

3．方案设计中的内切酶的选择虽然从理论上，我们的方案可以进行任意位点改造，但事实上在改造过程中会出现一系列的问题，包括扩增效率，碱基划移等一系列问题，使得改造方案失败。对此，我们公司专业开发了一个引物设计软件，通过运算获得最佳的改造方案，同时通过在正向和反向序列上同时设计方案，以保证试验的成功。

4．PCR产物的污染问题在大规模的PCR过程中，最严重的问题是PCR产物污染，据我们经验总结，80％以上的污染是由于接触式污染，剩余的污染则包括气溶胶污染等环境造成的污染。对于PCR污染这个问题，本公司制订了严格的实验措施，具体包括使用滤芯抢头、所有PCR体系全部分装、PCR体系与各类模板严格分离、配置体系人员与接触PCR产物人员严格分离等一系列措施，同时在处理PCR管，eppendorf管时也规定了详细的操作过程。

5．关于质量控制问题在每板PCR过程中，我们会放入两个阴性对照和一个重复对照，以确认PCR的过程中不会产生污染和PCR的结果确实可信。

技术基本原理和实例

采用的巢式PCR－RFLP分型技术，其基本原来是利用PCR引物的3’端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNP rs1321425（rs1321425－来自NCBI的refSNP数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是我们对SNP位点前的上游碱基进行改造，通过对序列的分析和PCR效果的计算，我们将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT