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采血
（一）材料与试剂
1．抗凝剂
（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml，市售肝素多为100U~126U／mg。
（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成4％的溶液备用。
（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：
枸橼酸钠（Na3C6H5O7·5H2O） 0.80g
枸橼酸 0.0325g
葡萄糖 2.05g
氯化钠 0.42g
H2O 加至 100.00ml
混匀溶解后，114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。
阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有 细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血 细胞的保存液。 2．针头 根据不同动物和采血部位，采用不同型号的针头，用前必须灭菌或消毒。
3．采血容器 注射器或三角瓶等。
4．采血动物。
（二）操作方法
1．采血法 各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。
2．抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝，采用什么方法进行抗凝，则根据实验的要求和条件而定。最常用的方法如下：
（1）肝素抗凝：采血时，使每ml血液含15U~20U肝素即可。计算采集的血液量，按1 000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血时，边采血边轻轻摇动，使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。
（2）EDTA抗凝：采血前，用灭菌生理盐水将EDTA配制成4％溶液，然后按预采血液的量，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内。采血，并不断摇动采血容器，使之混匀。
（3）玻璃珠法：预先将适量的玻璃珠（根据采血量多少而定）清洗后，装入采血容器中，灭菌后备用。采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但对淋巴 细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。 （4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红 细胞的保存。一般在4℃条件下，阿氏液中保存的红 细胞2周其活性和特性不变。
红细胞的分离技术
（一）材料与试剂
1．肝素等抗凝剂
2．3％明胶液 取明胶3g，溶于0.9％灭菌盐水100ml中，114.3℃灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存。临用时，37℃预热10min。
3．阿氏液
（二）操作方法
1．采血抗凝，即为红 细胞。由于红 细胞与白 细胞的比例相差悬殊，一般白 细胞混杂在其中，忽略不计。 2．根据红 细胞的用途，可做进一步的处理。如计算红 细胞，可直接稀释计数。如需做补体结合反应，或其它溶红 细胞反应，则需将红 细胞进行充分的清洗，以除去附着在红 细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗，2 000r/min离心10min，重复3~4次。 3．如需储藏备用，则以阿氏液做抗凝剂采血，混匀后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。
（一）材料与试剂
（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：
9％聚蔗糖液 24份
33.9％泛影葡胺液 10份
混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。一般可保存3个月。
如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：
式中dm为分层液的比重，d1和d2分别为9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液，则9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液
34％泛影葡胺液 10份
60％右旋糖酐液 12.5份
混合，即为比重1.07～1.09的分层液。分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
2． 3％的明胶液 称取明胶3g，溶于0.9％的灭菌生理盐水，终体积100ml，114.3℃高压灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存，临用时37℃预热10min。
3．Hank’s液。
（二）操作方法
1．取抗凝血，自然沉降，如是马属动物的血液，可直接直立试管架上，让其自然沉降1h，取上层血浆。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明胶液，混匀后让其自然沉降，1h后取上层血浆。
2．2 000r/min离心10min，弃上清。
3．沉淀用Hank’s液混悬后，再2 000r/min离心10min。
5．取2ml 细胞分层液于离心管内，同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆（自然沉降1h的上层血浆）轻轻加入分层液上，直接加抗凝血也可。 6．以水平转子离心机2 000r/min离心20min。离心后，可见分成多层，最下层是红 细胞，中间层是分层液，最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层，即为单个核 细胞层。 7．用毛细吸管插入到单个核 细胞层并吸取该层，放入另一试管中。 8．以Hank’s液洗涤、离心，最后配制成适当的白 细胞浓度。必要时可计数。 （三）注意事项
1．血浆或血液加入分层液中时要小心，缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。
2．保持淋巴 细胞的活性是非常重要的，所以一般情况下，是现采血，马上进行分离。 3．经过分层液分离的淋巴 细胞层，实际上是单个核 细胞层，包括单核 细胞，不包括粒 细胞。欲分离出纯的淋巴 细胞，则按下法除去单核 细胞，或收获单核 细胞。
T淋巴细胞的分离技术
（一）原理
混合单个核 细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B 细胞、浆 细胞、单核 细胞和一些辅助 细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T 细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T 细胞群的有效方法。 （二）材料及试剂
1．尼龙毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
3．装填尼龙毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核 细胞层。 （三）操作方法
1．尼龙毛的清洗与干燥
（1）戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1包或2包，每包35g）放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。
（2）冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。
（3）重复（1）、（2）步骤6次。
（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内。
2．装尼龙毛柱
（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。
（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠，以适应注射器的直径，填入注射器内，约20ml的体积。
（3）将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。
（1）将注射器固定在支架上，倒入37℃的 细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉 细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。 （2）将要分离的 细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00×10 7个 细胞／ml。 （3）将 细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。盖上注射器，37℃温育45min 至1h。
（4）打开下口，缓慢放流（1滴／min），收集于离心管中。
（6）关闭注射器下口，于注射器内加入0.85％冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴 细胞、浆 细胞、巨噬 细胞等。 （四）注意事项
1．此种分离法，T淋巴 细胞也常有一部分被吸附，吸附的多少与尼龙毛的质量有关，与装柱的松紧也有关系。 3．用过的尼龙毛可回收，以盐水洗涤，然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜，然后再同前法清洗。
（一）铁粉吸附法
1．材料及试剂
（1）铁粉或羰基铁粉（Atomergic chemetals）99％的纯度，颗粒小于60µm（Goodfellow Metals）。
（2）强磁铁（马蹄形）。
（3）一块小棒状磁铁（约1cm长）。
（4）毛细吸管等。
2．操作方法
（1）称取一定量的铁粉，一般为10g，用100ml生理盐水洗涤4次，去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时，用强磁铁吸住铁粉。
（2）用50ml生理盐水混悬铁粉。摇匀后，分装于10个瓶中，包扎瓶口，121℃灭菌20min，拿出后立即轻轻摇匀，防止铁粉结块，储藏备用。
（3）临用前，倒去瓶中的生理盐水，加入适量的单个核 细胞悬液（3ml～5ml， 细胞总数为8×10 7个／瓶）。37℃温育45min，中间不时晃动，使铁粉悬浮起来。 （4）加入一块小磁铁棒于瓶中，让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的 细胞。 （5）倒出悬液，此悬液主要是淋巴 细胞，离心，收集。 （6）在铁粉瓶内倒入一定量的Hank’s液，用力振摇后，以强磁铁吸附，几分钟后，倒出液体。
（7）2 000r/min离心液体，管底即为单核 细胞。 （二）玻璃板吸附法
将分离的单个核 细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置37℃ 30 min～40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴 细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿，收获即为单核 细胞悬液。
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